醋酸菌的分离纯化及初步鉴定

请注意,本文编写于 340 天前,最后修改于 60 天前,其中某些信息可能已经过时。

以下是醋酸菌的分离纯化及初步鉴定的计划实验步骤,有待正式实验进一步的修改。

测定方法

产酸测定:酸碱滴定法
感官质量:感官鉴定法
pH测定:酸度计
总糖的测定:直接测定法

醋酸菌分离纯化工艺流程

菌种富集一平板分离一纯化一产酸定性实验H]一初筛一产酸试验培养基1复筛一鉴定(生理生化)一产酸试验培养基2复筛

准备工作(按实验进度需求准备)

材料准备

  • 腐烂的苹果
  • 醋醅

试剂准备

  • NaOH溶液
  • 酚酞试剂
  • 无水乙醇
  • 冰乙酸
  • 结晶紫染液
  • 卢戈氏碘液
  • 番红试剂
  • FeCI₃溶液、H₂O₂溶液等

培养基

基础培养基:

葡萄糖l%,酵母膏1%,pH 4.5,121℃灭菌20 min,使用前加入3%无水乙醇。

富集培养基:

葡萄糖1%,酵母膏1%,KH₂PO₄ 0.5%,pH 5.5,0.1MPa灭菌30 min,灭菌后冷却到
70℃时加入95%酒精3%。

醋酸菌分离培养基:

酵母膏l%,葡萄糖1%,CaCO₃ 2%,95%酒精3%,琼脂2%,0.1 MPa灭菌30min(碳酸钙需干热灭菌,165℃下30 min),灭菌时不加入碳酸钙和酒精。

产酸试验培养基:

  • 产酸试验培养基1

    基础培养基临用前加入7%无水乙醇,分装于500 mL三角瓶,每
    瓶50 mL;

  • 产酸试验培养基2

    8度Bx麦芽汁100 mL,pH 4.5,灭菌后加入7%的无水乙醇,分装于500 mL三角瓶,每瓶70 mL。

以上培养基用冰乙酸调pH值。

生酮实验培养基:

3%甘油、3%酵母膏、2%琼脂

产5一酮基葡萄糖酸盐培养基:

3%葡萄糖,2%碳酸钙,1%酵母膏,2%琼脂

产葡萄糖酸培养基:

3%酵母膏,10%葡萄糖,3%碳酸钙,2%琼脂。

第一天 菌种富集

取一定量烂苹果、梨以及醋醅等接种子富集培养基中,置于摇床中培养2-3天富集培养。

第三天 平板分离

分别取上述富集培养液0.2 mL用涂布法涂布在分离平板上,置于恒温箱中培养2-3天,得单菌落。

第六天 纯化

挑取菌落较小,透明圈较大,菌落形态一致,生长占优势的单个菌落划线接种于分离培养基中纯化,30℃培养48 h后保藏于4℃冰箱

第八天 初筛

将上述产酸菌接种于产酸实验培养基1,每株一瓶,于30℃静置培养5天后,滴定酸度并比较。

第十三天 复筛(1)

将初筛选出的菌株各接种于2支装有4 mL基础培养基的大试管,30℃振荡培养20 h,每支试管转入两瓶产酸实验培养基2,30℃ 120 r/min振荡培养5天后测定产酸量并比较。

第十八天 产酸量的测定

取2 mL发酵液,加入50 mL蒸馏水,3-5滴 0.5%酚酞酒精溶液,用标定0.1 mol/L NaOH溶液滴定至浅粉色。由耗用的Na0H溶液的体积计算样品中的含酸量(以醋酸计)。

产酸量(g/L)=(V—V₀)×C NaOH ×60/L
V为发酵液样品滴定耗用的NaOH(mL)数
V₀为以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH(mL)数
C NaOH为标准NaOH溶液的浓度(mol/L)。
L为样品体积(mL)
60为醋酸分子量

复筛(2)

将复筛(1)中选出的4个产醋酸细菌菌株各接种于lO mL基础培养基,30℃静置培养20 h后转接人乙醇含量分别为5%,7%.9%,11%的产酸试验培养基,静置培养5天后分别测定产酸量并比较之。每一菌株每一乙醇体积分数做两个平行样品。

鉴定(生理生化)

形态观察对培养到18-24 h的斜面菌种进行革兰氏染色,镜检。

生理生化试验(属水平的鉴定)乙醇的氧化与过氧化反应鉴定方法:在鉴定培养基平板上点种待测菌株,每一平板可点种4-6个菌落,30"-32℃培养3,7,14天观察结果。

种属鉴定方法:将4株产酸高菌株分别接种于生酮实验培养基、产5-酮基葡萄糖酸盐培养基、产葡萄糖酸培养基中培养。根据观察的结果判定醋酸菌的种属。

参考

论文 :孙万里 醋酸菌的分离纯化及初步鉴定

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已有 12 条评论

想看图,醋酸菌的菌落长什么样?

Mikusa Mikusa 回复 @熊猫小A
0 0

这只是设计实验,还没开始做呢
不过参考牡丹的菌
应该长得差不多

长见识了#(呲牙)

这个太硬核了,文科生看不懂呀@(狂汗)

哈哈哈看不懂就达到我的目的了#(高兴)

我也好想做实验啊。。。球蛋白提纯、碱磷之类的只是书上看到过,没机会碰。。。粗提纯DNA那些实验好像就高中的时候做过,PCR之类的高中没有,哎。。。

高中就做过DNA粗提了???

球蛋白提纯我还没见过欸……

高中有的。。。人教版生物书上实验其实都有这些,还有什么蛋白质盐析、苏丹三测脂肪之类的,不过好多学校都懒得开实验。

出现啦!超专业的文章!

其实是网上的实验论文……