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醋酸菌的分离纯化及初步鉴定 (终版)

• 2018 年 11 月 27 日 • 阅读: 210 • 实验

改一改二再改三,不改了……
二改:https://www.himiku.com/archives/53.html
初版:https://www.himiku.com/archives/48.html

培养基

  • 基础培养基:葡萄糖1%,酵母膏1%,无水乙醇3%vol,pH 4 .5;
  • 分离培养基:基础培养基加入琼脂2%,碳酸钙2%,无水乙醇3%v01;
  • 斜面保藏培养基:基础培养基加入琼脂2%,碳酸钙1%,无水乙醇3%vol;
  • 产酸培养基:基础培养基经灭菌冷却后加入7%vol无水乙醇,分装250mL三角瓶,每瓶50mL 。

以上培养基均经过121℃灭菌20min;碳酸钙经过干热灭菌(165℃、30min)。培养基灭菌结束后,待温度降至70℃时加入碳酸钙和无水乙醇。

分离筛选流程及操作步骤

分离筛选流程

菌源制备—扩大培养—稀释分离—菌株纯化—斜面保藏—产醋酸定性试验—菌株初筛—菌株复筛—稳定性试验

流程图

st=>start: 菌种制备
e=>end: 菌株复筛
op=>operation: 扩大培养
cond=>condition: 是否产菌?
op5=>operation: 稀释分离
op1=>operation: 菌株纯化
op2=>operation: 斜面保藏
op3=>operation: 产醋酸定性试验
c1=>condition: 是否产酸?
op4=>operation: 菌株初筛

st->op->cond
cond(yes)->op5
cond(no)->op
op5->op1->op2->op3->c1
c1(yes)->op4
c1(no)->op5
op4->e

操作步骤

1. 菌源制备

​将醋曲、腐烂苹果取少量用无菌生理盐水浸泡1小时后,进行扩大培养。

2. 扩大培养

​ 从自然发酵的苹果醋液、醋曲液、腐败苹果液中称取10g醋样于盛有100mL基础培养基的500mL 三角瓶中,在30℃、120r/min条件下振荡培养48h。

3. 稀释分离

​ 取1mL培养液于盛有9mL无菌水的试管中,依次用无菌水稀释,获得最终浓度为10-4、10-5、10-6 、l0-7 的培养液。分别取各浓度的稀释培养液0.2mL,涂布法接种于分离培养基上,在30℃培养72h。从培养基上挑取菌落形态一致,透明圈大,菌落丰厚且生长优势的单菌落。

4. 菌株纯化

​ 将以上得到的单菌落在平板培养基上多次划线分离、培养、确认为形态一致的单菌落后,接种于斜面保藏培养基上,在30℃培养72h后保藏于4℃冰箱内。

5. 革兰氏染色

​ 将上述试管斜面上的菌株活化2次后革兰氏染色。

6. 产酸定性实验

​ 将上述斜面保藏菌种分别接种于含3%vol乙醇的基础培养基中,在30℃浅层培养72h后,取5ml除去菌体的培养液,以2.5mol/l的NaOH溶液中和pH值至7.0,加入5%FeCl3溶液5到6滴,形成红褐色沉淀者为产醋酸细菌。

7. 菌株初筛

​ 根据革兰氏染色和产酸定性试验得到的单菌落菌株,在平板培养基上进一步分离。根据其HC值(变色圈直径与菌落直径的比值)。

8. 菌种复筛

​ 将初筛菌种分别接种于产酸培养基上,每株3次重复,在30℃静置培养120h后,测定酸度并比较。

9. 醋酸产量与酒精转化率的测定

醋酸产量测定:取2ml发酵液,加入50ml蒸馏水,3至5滴0.5%酚酞酒精溶液,用标定的0.1ml/NaOH溶液滴定至浅粉色,由消耗的NaOH溶液的体积来计算样品中的含酸量。

菌株分离筛选结果

革兰氏染色

食醋醋曲经稀释分离与反复划线后确定出4株形态一致的单菌落,斜面保存活化后进行革兰氏染色

产酸定性实验结果

按照产酸定性试验操作规程操作加入5%FeCl3溶液

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已有 6 条评论
  1. 鬼要看你做实验啊,快女装@(阴险)

    1. @littleplus还说我,倒是你啥时候女装啊#(脸红)

  2. 惊现技术博主!

    1. @读来依然我不是我没有!

  3. 一篇文章水三遍,大佬大佬@(滑稽)

    1. @半吊子的静树等第四遍吧@(滑稽)