培养基

  • 基础培养基：葡萄糖1％，酵母膏1％，无水乙醇3％vol，pH 4 .5；
  • 分离培养基：基础培养基加入琼脂2％，碳酸钙2％，无水乙醇3％v01；
  • 斜面保藏培养基：基础培养基加入琼脂2％，碳酸钙1％，无水乙醇3％vol；
  • 产酸培养基：基础培养基经灭菌冷却后加入7％vol无水乙醇，分装250mL三角瓶，每瓶50mL 。

以上培养基均经过121℃灭菌20min；碳酸钙经过干热灭菌(165℃、30min)。培养基灭菌结束后，待温度降至70℃时加入碳酸钙和无水乙醇。

分离筛选流程及操作步骤

分离筛选流程

菌源制备—扩大培养—稀释分离—菌株纯化—斜面保藏—产醋酸定性试验—菌株初筛—菌株复筛—稳定性试验

操作步骤

1. 菌源制备

​将醋曲、腐烂苹果取少量用无菌生理盐水浸泡1小时后，进行扩大培养。

2. 扩大培养

​ 从自然发酵的苹果醋液、醋曲液、腐败苹果液中称取10g醋样于盛有100mL基础培养基的500mL 三角瓶中，在30℃、120r/min条件下振荡培养48h。

3. 稀释分离

​ 取1mL培养液于盛有9mL无菌水的试管中，依次用无菌水稀释，获得最终浓度为10-4、10-5、10-6 、l0-7 的培养液。分别取各浓度的稀释培养液0.2mL，涂布法接种于分离培养基上，在30℃培养72h。从培养基上挑取菌落形态一致，透明圈大，菌落丰厚且生长优势的单菌落。

4. 菌株纯化

​ 将以上得到的单菌落在平板培养基上多次划线分离、培养、确认为形态一致的单菌落后，接种于斜面保藏培养基上，在30℃培养72h后保藏于4℃冰箱内。

5. 革兰氏染色

​ 将上述试管斜面上的菌株活化2次后革兰氏染色。

6. 产酸定性实验

​ 将上述斜面保藏菌种分别接种于含3%vol乙醇的基础培养基中，在30℃浅层培养72h后，取5ml除去菌体的培养液，以2.5mol/l的NaOH溶液中和pH值至7.0，加入5%FeCl3溶液5到6滴，形成红褐色沉淀者为产醋酸细菌。

7. 菌株初筛

​ 根据革兰氏染色和产酸定性试验得到的单菌落菌株，在平板培养基上进一步分离。根据其HC值（变色圈直径与菌落直径的比值）。

8. 菌种复筛

​ 将初筛菌种分别接种于产酸培养基上，每株3次重复，在30℃静置培养120h后，测定酸度并比较。

9. 醋酸产量与酒精转化率的测定

醋酸产量测定：取2ml发酵液，加入50ml蒸馏水，3至5滴0.5%酚酞酒精溶液，用标定的0.1ml/NaOH溶液滴定至浅粉色，由消耗的NaOH溶液的体积来计算样品中的含酸量。

菌株分离筛选结果

革兰氏染色

食醋醋曲经稀释分离与反复划线后确定出4株形态一致的单菌落，斜面保存活化后进行革兰氏染色

产酸定性实验结果

按照产酸定性试验操作规程操作加入5%FeCl3溶液

本文作者：mikusa

本文链接：https://www.himiku.com/archives/acetic-acid-bacteria.html

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